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GATK 4 Mutect2 Somático

Análise Somática

GATK 4 Mutect2 Somático

T12020 - Aula Prática

Pipeline

• GATK4 - Mutect2
• Gene JAK2
• Referência chr9
  • Sobre as versões do Genoma Humano: https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890711-GRCh37-hg19-b37-humanG1Kv37-Human-Reference-Discrepancies#grch37
• Amostras:
  • WP043 (tumor)
  • WP044 (normal)
• https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035894731-Somatic-short-variant-discovery-SNVs-Indels-

Amostras Extras

• WP190 (tumor) e WP191 (normal)
• WP017 (tumor) e WP018 (normal)

Nota 1: Utilizar o af-gnomad chr13 e chr19.

Nota 2: Será preciso baixar o chr13 e chr19 da UCSC.

Download chr19

wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr19.fa.gz

Download chr13

wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr13.fa.gz

Concatenar os arquivos .fa.gz

Dica 1: zcat lê arquivos compactados .gz e zip

zcat chr13.fa.gz chr19.fa.gz | sed -e "s/chr//g" > hg19.fa

Gerar o index do arquivo hg19.fa

samtools faidx hg19.fa

---

< Primeiro é o chr9 >

    \   ^__^
     \  (oo)\_______
        (__)\       )\/\
            ||----w |
            ||     ||

Workflow

Os arquivos BAM (tumor e normal) já foram gerados e estão prontos para a chamada de variates (ver Anexo 1). Então, agora vamos fazer download da referência chr9 e gerar o index com o programa samtools.

Download da Referência - chr9

• Download

wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr9.fa.gz

• Alterar nome do header: DE: >chr9 para >9

Essa alteração é necessária pois no BAM a referência não tinha >chr era apenas >9.

zcat chr9.fa.gz | sed -e "s/chr//g" > chr9.fa

• Verificar se alteração foi feita com o comando head

head chr9.fa

O comando head lê as 10 primeiras linha de um arquivo texto

samtools

Samtools is a suite of programs for interacting with high-throughput sequencing data. It consists of three separate repositories:

samtools install. Escolher um dos instaladores (todo terminal virtual é Ubuntu)

• samtools install (Mac)

brew install samtools 

• samtools install (Ubuntu)

sudo apt-get install samtools 

• samtools install (Docker)

docker pull biocontainers/samtools

samtools faidx e index (cria um dicionário do arquivo chr9.fa)

• samtools faidx

samtools faidx chr9.fa

GATK4

Version: 4.2.2.0

Genome Analysis Toolkit - Variant Discovery in High-Throughput Sequencing Data. https://gatk.broadinstitute.org/

GATK4 install

GATK4 install Mac e Linux

• Download

wget -c https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.2.2.0/gatk-4.2.2.0.zip

• Descompactar

unzip gatk-4.2.2.0.zip 

• Testando gatk

./gatk-4.2.2.0/gatk

GATK4 .dict

./gatk-4.2.2.0/gatk CreateSequenceDictionary -R chr9.fa -O chr9.dict

GATK4 intervals

./gatk-4.2.2.0/gatk ScatterIntervalsByNs -R chr9.fa -O chr9.interval_list -OT ACGT ##ACTG é a descrição de quais bases devem ser selecionadas no novo arquivo, o que exclui os Ns

Mutect2

Call somatic SNVs and indels via local assembly of haplotypes

Mutect2 Tumor e Normal

O comando: samtools view -H normal_JAK2.bam você consegue pegar o campo SM: que contém o ID da amostra normal.

./gatk-4.2.2.0/gatk Mutect2 \
	-R chr9.fa \ ##referencia a ser usada
	-I tumor_JAK2.bam \ ##input 
	-I normal_JAK2.bam \  ##outro input
	-normal WP044 \  ## argumento "-normal" direciona qual a amostra normal
	--germline-resource af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \  ##frequencia alelica vinda do Gnomad para saber se é germinativo ou não
	-O somatic.vcf.gz \
	-L chr9.interval_list  ##quais regiões devem ser consideradas para chamar variante

##extra

./gatk-4.2.2.0/gatk Mutect2 \
	-R hg19.fa \
	-I tumor_wp190.bam \ 
	-I tumor_wp191.bam \ 
	-normal WP191 \  
	--germline-resource af-only-gnomad-chr13-chr19.vcf.gz \  
	-O somatic_wp190.vcf.gz \
	-L hg19.interval_list  

Calcular Contaminação

GetPileupSummaries

Tabulates pileup metrics for inferring contamination

• GetPileupSummaries Tumor

./gatk-4.2.2.0/gatk GetPileupSummaries \
	-I tumor_JAK2.bam \
	-V af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \  (referência da frequência alélica)
	-L chr9.interval_list \
	-O tumor_JAK2.table

• GetPileupSummaries Normal

./gatk-4.2.2.0/gatk GetPileupSummaries \
	-I normal_JAK2.bam \  
	-V af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \
	-L chr9.interval_list \
	-O normal_JAK2.table

CalculateContamination

Calculate the fraction of reads coming from cross-sample contamination (compara quantitativamente a frequência alélica de todas as variantes encontradas com a freq. alélica descrita pelo gnomad, neste caso, gerando score e desvio padrão. Para o CalculateContamination o score acima de 2 é contaminação. Importante lembrar que estamos olhando só um gene e esse cálculo pode ser pouco eficiente pela região ser pequena)

./gatk-4.2.2.0/gatk CalculateContamination \
	-I tumor_JAK2.table \ ##arquivo de interesse 
	-matched normal_JAK2.table \  #com qual será comparado
	-O contamination.table

FilterMutectCalls

Filter somatic SNVs and indels called by Mutect2 (considera diversos fatores como qualidade da base, da read, do alinhamento, das regiões ao redor, se está presente nas duas fitas, se está presente só na amostra normal ou no tumor para determinar se é artefato "artefact" ou variante mesmo "PASS")

./gatk-4.2.2.0/gatk FilterMutectCalls \
	-R chr9.fa \
	-V somatic.vcf.gz \  ##arquivo vcf a ser usado
	--contamination-table contamination.table \  ##table de contaminação 
	-O filtered.vcf.gz

##* é interessante abrir o VCF, bam e bai das amostras no IGV para visualizar as regiões filtradas

VEP ensembl - Anotação

VEP install

docker pull ensemblorg/ensembl-vep

• Criar diretório de output do VEP com permissão total (aplicado apenas no gitpod)

Voltar para a casa

cd

Verificar se o diretório é o /home/gitpod

pwd

ex.: /home/gitpod

Copiar o arquivo filtered.vcf.gz

cp /workspace/somatico/filtered.vcf.gz .

Copiar o arquivo chr9.fa

cp /workspace/somatico/chr9.fa .

Copiar o arquivo chr9.fa.fai

cp /workspace/somatico/chr9.fa.fai .

Criar o diretorio vep_output

mkdir -p vep_output

Modificar a permissao do diretorio vep_output

chmod 777 vep_output

• Aplicar apenas no Google Colab

mkdir -p vep_output
chmod 777 vep_output

rodar o vep

docker run -it --rm  -v $(pwd):/data ensemblorg/ensembl-vep ./vep  \
	-i /data/filtered.vcf.gz  \
	-o /data/vep_output/filtered.vep.tsv \
	--database --assembly GRCh37 --refseq  \
	--pick --pick_allele --force_overwrite --tab --symbol --check_existing \
	--fields "Location,SYMBOL,Consequence,Feature,Amino_acids,CLIN_SIG" \
	--fasta /data/chr9.fa \
	--individual all 

Panel of Normal (PoN)

Panel of Normal (PoN)

GATK Best Practices - Exome PoN

• vcf

wget -c https://storage.googleapis.com/gatk-best-practices/somatic-b37/Mutect2-exome-panel.vcf

• vcf.idx

wget -c https://storage.googleapis.com/gatk-best-practices/somatic-b37/Mutect2-exome-panel.vcf.idx

• Mutect2

./gatk-4.2.2.0/gatk Mutect2 \
  -R hg19.fa \
  -I tumor_wp190.bam \
  --germline-resource af-only-gnomad-chr13-chr19.vcf.gz \
  --panel-of-normals Mutect2-exome-panel.vcf \
  -L hg19.interval_list \
  -O WP190.somatic.pon.vcf.gz
  

• CalculateContamination somente com o table do tumor (ex.: wp190)

./gatk-4.2.2.0/gatk CalculateContamination \
	-I tumor_wp190.table \
	-O WP190.contamination.pon.table

• FilterMutectCalls

./gatk-4.2.2.0/gatk FilterMutectCalls \
	-R hg19.fa \
	-V WP190.somatic.pon.vcf.gz \
	--contamination-table WP190.contamination.pon.table \
	-O WP190.filtered.pon.vcf.gz

Anexo 1

Converter BAM para FASTQ

samtools view -h -b /Volumes/Seagate\ Expansion\ Drive/data-lpfap10/projects/proadi/exome/bam/WP043/WP043.bam 9:5021937-5126899 | samtools bam2fq -1 tumor_R1.fq -2 tumor_R2.fq - 

samtools view -h -b /Volumes/Seagate\ Expansion\ Drive/data-lpfap10/projects/proadi/exome/bam/WP044/WP044.bam 9:5021937-5126899 | samtools bam2fq -1 normal_R1.fq -2 normal_R2.fq - 

Converter BAM para JAK2 BAM

Aqui estão os comandos que foram utilizados para gerar os BAMs intermediários e como gerar arquivos FASTQs de regiões específicas do seu arquivo BAM completo.

Essas etapas não precisam ser executadas nesse pipeline

• BAM para BAM

samtools view -h -b /Volumes/Seagate\ Expansion\ Drive/data-lpfap10/projects/proadi/exome/bam/WP043/WP043.bam 9:5021937-5126899 > tumor_JAK2.bam

samtools view -h -b /Volumes/Seagate\ Expansion\ Drive/data-lpfap10/projects/proadi/exome/bam/WP044/WP044.bam 9:5021937-5126899 > normal_JAK2.bam

• Gerar index do BAM (.BAI)

samtools index tumor_JAK2.bam 

samtools index normal_JAK2.bam 

af-only-gnomad.vcf.gz (apenas região JAK2)

Google Clou af-only-gnomad.vcf.gz

• Header do VCF

zgrep -w "\#" af-only-gnomad.raw.sites.chr.vcf.gz > header

• Apenas Região do Gene JAK2

zgrep -w "^chr9" af-only-gnomad.raw.sites.chr.vcf.gz  | awk '$2>=5021937 && $2<=5126899' > JAK2.region

• Concatenar header + vcf

cat header JAK2.region > af-only-gnomad-chr9.vcf

• Compactar

bgzip af-only-gnomad-chr9.vcf

• Index do VCF

tabix -p vcf af-only-gnomad-chr9.vcf.gz 

Anexo 2

Rodar amostras extras pareadas:

• Com par:

sh run.chr13-chr19.sh tumor_JAK2.bam normal_JAK2.bam WP043 WP044
sh run.chr13-chr19.sh tumor_wp017.bam tumor_wp018.bam WP017 WP018
sh run.chr13-chr19.sh tumor_wp190.bam tumor_wp191.bam WP190 WP191

• Com PoN:

sh run.chr13-chr19.pon.sh tumor_JAK2.bam normal_JAK2.bam WP043 WP044 
sh run.chr13-chr19.pon.sh tumor_wp017.bam tumor_wp018.bam WP017 WP018 
sh run.chr13-chr19.pon.sh tumor_wp190.bam tumor_wp191.bam WP190 WP191 

Código Fonte (run.chr13-chr19.pon.sh e run.chr13-chr19.sh)

# variaveis fixas
gnomad="af-only-gnomad-chr13-chr19.vcf.gz"
interval="hg19.interval_list"
genome="hg19.fa"

# bam e ids 
tumor=$1
normal=$2
id_tumor=$3
id_normal=$4

# rodando mutect2
./gatk-4.2.2.0/gatk Mutect2 \
	-R $genome \
	-I $tumor \
	-I $normal \
	-normal $id_normal \
	--germline-resource $gnomad \
	-O $id_tumor.somatic.vcf.gz \
	-L $interval

# getPileup tumor
./gatk-4.2.2.0/gatk GetPileupSummaries \
	-I $tumor \
	-V $gnomad \
	-L $interval \
	-O $id_tumor.table

# getPileup normal
./gatk-4.2.2.0/gatk GetPileupSummaries \
	-I $normal \
	-V $gnomad \
	-L $interval \
	-O $id_normal.table

# CalculateContamination
./gatk-4.2.2.0/gatk CalculateContamination \
	-I $id_tumor.table \
	-matched $id_normal.table \
	-O $id_tumor.contamination.table

# FilterMutectCalls
./gatk-4.2.2.0/gatk FilterMutectCalls \
	-R $genome \
	-V $id_tumor.somatic.vcf.gz \
	--contamination-table $id_tumor.contamination.table \
	-O $id_tumor.filtered.vcf.gz

Rodar amostras extras com Panel of Normal (broad institute).

# variaveis fixas
gnomad="af-only-gnomad-chr13-chr19.vcf.gz"
interval="hg19.interval_list"
genome="hg19.fa"
pon="Mutect2-exome-panel.vcf"

# bam e ids 
tumor=$1
id_tumor=$3

# rodando mutect2
./gatk-4.2.2.0/gatk Mutect2 \
	-R $genome \
	-I $tumor \
	--germline-resource $gnomad \
	--panel-of-normals $pon \
	-O $id_tumor.somatic.pon.vcf.gz \
	-L $interval

# getPileup tumor
./gatk-4.2.2.0/gatk GetPileupSummaries \
	-I $tumor \
	-V $gnomad \
	-L $interval \
	-O $id_tumor.pon.table

# CalculateContamination
./gatk-4.2.2.0/gatk CalculateContamination \
	-I $id_tumor.pon.table \
	-O $id_tumor.contamination.pon.table

# FilterMutectCalls
./gatk-4.2.2.0/gatk FilterMutectCalls \
	-R $genome \
	-V $id_tumor.somatic.pon.vcf.gz \
	--contamination-table $id_tumor.contamination.pon.table \
	-O $id_tumor.filtered.pon.vcf.gz